好氧堆肥用枯草芽孢杆菌GX2产芽孢工艺优化（一）

好氧堆肥化是好氧有机固体销毁物减量化、有害化及资源化的堆肥实用道路之一，是用枯芽孢优化在微生物熏染下经由高温发酵使有机物酿成腐熟肥料的历程。好氧堆肥不光含有大批可被植物罗致使用的草芽X产实用态氮、磷、孢杆钾及其化合物，工艺而且含有组成土壤肥力的好氧紧张活性物资腐殖质，既处置了有机同体销毁物的堆肥情景传染下场，又起到改善土壤以及削减肥效的用枯芽孢优化熏染。在好氧堆肥历程中削减外源微生物菌剂可实用后退堆体中功能微生物的草芽X产数目，减速有机物转化及堆肥历程，孢杆后退肥效。工艺Xi等经由接种复合菌剂削减堆肥历程中细菌的好氧多样性，可实用后退堆肥功能。堆肥Zhao等发如今堆肥历程中接种放线菌可清晰后退纤维素酶活性，用枯芽孢优化减速纤维素降解，后退腐殖质含量，削减温室气体排放。微生物菌剂的运用下场与活菌数亲密相关，实用活菌数是掂量微生物菌剂品质的紧张目的，可是，随着微生物菌剂保存光阴的缩短，活菌数不断削减，飞腾菌剂的运用下场，同时，微生物菌剂的制备老本较高，影响了其工业化运用。

芽孢杆菌具备较强的抗逆性，能耐热、酸以及碱等不良情景，可实用坚持菌剂中的微生物活性，后退菌剂品质及运用下场王雪莲等接管照应面法对于影响枯草芽孢杆菌B579的哺育基妨碍了优化，为进一步后退细胞浓度以及后续淘汰哺育提供参考，同时，对于其产芽孢条件妨碍了优化。王法国等经由单因素试验、Plackett-Burman试验妄想以及照应面法对于解淀粉芽孢杆菌JT84的哺育基成份以及发酵条件妨碍了优化，所患上发酵液的芽孢含量为1.67×109CFU/mL，与根基哺育基比照，后退了159％。郭晓军等经由对于堆肥用产卵白酶菌株的单因素、正交试验产芽孢条件优化，芽孢产率达95.0％，为处置以芽孢杆菌为主的微生物菌剂财富化破费历程中存在的活性低等下场提供了紧张参考。

作者收集污泥与秸秆混合好氧堆肥样品，妨碍微生物初筛、复筛及分说纯化，份子判断后取患上一株用于好氧堆肥的枯草芽孢杆菌GX2，具备耐高温、耐酸等特色，将其运用于堆肥历程能实用延迟堆肥周期，后退堆肥品质。针对于上述枯草芽孢杆菌GX2，经由摇瓶哺育条件优化，在3L发酵罐中经由火批补料技术进一步后退细胞浓度，并经由单因素以及正交试验优化产芽孢工艺条件，可为飞腾其发酵及菌剂制备老本提供有利参考。

1 质料与措施

1.1 试验质料

堆肥用菌株：好氧堆肥用枯草芽孢杆菌GX2为试验室保存菌株；种子哺育基：卵白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.2±0.2；计数哺育基：卵白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH为7.0～7.2；摇瓶及3L发酵罐的根基哺育基：酪卵白胨15g/L，大豆卵白胨5g/L，NaCl5g/L，pH7.3，消泡剂0.2％(体积分数)；补料哺育基：50g/L的蔗糖溶液；营养肉汤、营养琼脂、胰卵白胨、牛肉浸膏、硫酸锰、蔗糖以及硝酸钠：上海国药总体产物。

1.2 试验措施

1.2.1 菌株活化及种子液制备

将4℃冰箱内珍藏的菌株接入已经灭菌的液体肉汤哺育基中，摇床上45℃、160r/min活化12h后，在同体营养琼脂哺育基上三区平板划线，置于45℃哺育箱中哺育24h，筛选三区单菌落传代两次后，作为发酵菌株运用。

挑取已经活化的发酵菌株单菌落，接种于装有100mL已经灭菌的肉汤哺育基250mL三角瓶中，置于摇床振荡哺育，在温度为45℃，转速为160r/min哺育12h作为种子液。

1.2.2 摇瓶哺育基及哺育条件优化

在摇床发酵哺育基的根基上，以0D值为目的，对于菌株GX2妨碍碳源种类(葡萄糖、蔗糖、淀粉)、最佳碳源品质浓度(五、十、20、30、40g/L)、氮源种类(酵母粉、氯化铵、硝酸钠)、最佳氮源品质浓度(五、十、1五、20、25g/L)、装液量(50、100、150、200mL)的单因素优化。摇床哺育的初始条件为温度45℃，转速160r/min,装液量100mL(250mL)，pH7.3。试验在统一时问取样测定0D值来优化哺育基及其哺育条件,优化后的哺育基用于发酵罐哺育。每一组试验3次一再，服从取平均值。

1.2.3 发酵罐分批补料哺育

发酵罐型号为B10TECH-3JG-3JG-9000D，上海保光公司产物。在前期摇床哺育基以及哺育条件优化的根基上，将发酵罐初始条件配置为使命体积1.5L、压力0.05MPa、搅拌转速300r/min、温度45℃、接种量为1×107CFU/mL，经由流加3mol/L的Na0H以及HCl将DH值自动操作在7.3。将3L发酵罐妨碍灭菌，而后装入1.5L发酵哺育基于121℃灭菌30min，掏出后将温度、pH、转速、溶氧配置在初始条件，以1×10⁷CFU/mL的接入量接种别致活化的GX2种子液。

分批发酵是在上述条件下上罐妨碍菌株发酵，测定发酵历程中0D值、残糖浓度、活菌数，取患上菌株在发酵罐上的补料光阴以及补料量。分批补料发酵是在分批发酵的根基上，当总糖量破费一半时,退出碳源至原浓度，不断发酵哺育，当细胞浓度抵达晃动时停止补料发酵。以最大0D值以及最大活细胞数作为参考值，来合因素批发酵以及分批补料发酵的下场。

在分批补料发酵的根基上，取样测定活菌数以及芽孢数，绘制芽孢曲线图。在产芽孢时开始操作条件来优化芽孢率，并在芽孢率最大时取样测定。

1.2.4 发酵罐哺育条件优化

1)单因素优化芽孢率在发酵罐分批补料优化的根基上，分说钻研哺育温度、搅拌转速以及pH值对于芽孢杆菌产芽孢的影响。

2)正交试验优化芽孢率凭证单因素试验服从患上到的pH(4)，温度(B)、转速(C)的根基上，妄想3因素3水公平交试验，并凭证正交试验数据的极差合成，患上到菌株产芽孢的最佳发酵条件。

3)追加验证实验凭证正交试验合成的最佳发酵哺育条件，妨碍追加验证实验。

1.3 合成测试名目与措施

细胞浓度：接管比色法，以空缺哺育基作参比.在600nm处测定发酵液0D值。活细胞数：接管稀释平板哺育计数法，发酵液妨碍10倍稀释后，涂布平板妨碍活菌计数。

芽孢数：将发酵液在70℃下处置15min后。冷却，接管稀释梯度平皿计数法统计活菌数。

芽孢率：芽孢数占活菌数的百分数。

总糖含量：接管3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法。

2 服从与合成

2.1 摇瓶哺育条件优化

2.1.1 妨碍曲线绘制

微生物菌株妨碍艰深履历延滞期、对于数生临时、晃动期以及崛起期4个阶段。首先是菌体妨碍的畅通期，妨碍飞快，细胞浓度根基不会削减；顺应新情景后，微生物妨碍孳生速率减速，细胞浓度快捷后退，进入对于数生临时：尔后，随着底物不断被破费，细胞浓度进入晃动期：底物进一步破费殆尽，微生物生前途入衰产期，细胞浓度清晰着落。绘制微生物菌株的妨碍曲线可为其哺育条件优化提供紧张参考，图1给出了枯草芽孢杆菌GX2的发酵液0D值随哺育时问的变更情景。

由图1可知，细胞浓度在前期有持久的妨碍妨碍期，之后发酵液在波长600nm处的吸光度呈直线回升趋向，至14h时，细胞浓度抵达最大，A_600nm为1.698，之后开始着落。个别情景下，处于对于数生临时的菌株去世气愿望最强，细胞浓度也最高，因此，判断14h为枯草芽孢杆菌GX2的最佳哺育光阴，并用作后续摇瓶哺育条件优化钻研的发酵妨碍时问。

申明：本文所用图片、翰墨源头《食物与生物技术学报》，版权归原作者所有。如波及作品内容、版权等下场，请与本网分割

相关链接：5-二硝基水杨酸，胰卵白胨，硝酸钠，消泡剂

最新评论